產(chǎn)品描述
　　Quick Cell支原體快速檢測(cè)試劑盒(細(xì)胞培養(yǎng))是專門用于快速檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清或別的液體樣品(如血清)中是否存在支原體污染的試劑。本試劑盒操作簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間短，只需吸取1 μl細(xì)胞培養(yǎng)上清加入反應(yīng)體系中，60℃孵育1h，肉眼觀察即可判定結(jié)果，與傳統(tǒng)檢測(cè)支原體的PCR法優(yōu)勢(shì)明顯。本試劑盒檢測(cè)范圍廣，可以檢測(cè)：(1)M.Hyorhinis、(2)M.Fermentans、(3)M.Arginini、(4)M. hominis、(5)M. orale、(6)M. salivarium、(7)M.pirum、(8)Acholeplasma Laidlawii、(9)M. agalactiae、(10)M.bovis、(11)M. buccale、(12)M. arthritidis、(13)M. pulmonis等幾乎所有常見的污染細(xì)胞的支原體(M.為Mycoplasma的縮寫)。以上13種支原體約占細(xì)胞支原體污染的99%以上。絕大多數(shù)支原體污染集中于前8種。因此非常適合于與細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)的科研實(shí)驗(yàn)室及企業(yè)的日常支原體檢測(cè)。【注】：快速法不能檢測(cè)尿解，肺支原體。
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產(chǎn)品組分

【注】：①本試劑盒所指50次測(cè)試包含陰性對(duì)照、陽性對(duì)照，并非50個(gè)樣品，因每次測(cè)試均需設(shè)置對(duì)照，測(cè)試樣品數(shù)根據(jù)實(shí)驗(yàn)安排確定，理論上一次最多可測(cè)試48個(gè)樣品。②使用前用離心機(jī)輕微離心，以免管壁上粘附損失試劑減少檢測(cè)次數(shù)。 （注：陽性支原體DNA無需離心。)
運(yùn)輸與保存
藍(lán)冰運(yùn)輸。-20℃保存，有效期36個(gè)月。
實(shí)驗(yàn)操作流程
1.待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清收集
為了準(zhǔn)確判斷細(xì)胞是否有支原體的污染，待測(cè)的細(xì)胞培養(yǎng)液樣品最好來源于至少培養(yǎng)3 d且匯合度70-90%左右的細(xì)胞培養(yǎng)上清(貼壁細(xì)胞)。懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞也需要在換液傳代后，至少讓細(xì)胞生長(zhǎng)3 d再取培養(yǎng)液進(jìn)行檢測(cè)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞的存在不會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。細(xì)胞培養(yǎng)上清可直接用于檢測(cè)，但樣品中如果含有EDTA等影響支原體DNA擴(kuò)增的成分，建議進(jìn)行樣品處理，處理過程如下：
樣品處理：（1）根據(jù)濃縮倍數(shù)，可以取100-1500μL上述待測(cè)樣品到1.5 mL離心管內(nèi)，在普通臺(tái)式離心機(jī)上1000 rpm低速離心5 min，將離心后的上清轉(zhuǎn)移到另一個(gè)離心管內(nèi)，丟棄細(xì)胞沉淀。（2）將上清繼續(xù)13000 rpm（約 16000 g）高速離心 5 min，小心吸走全部上清，用 50 μL 5 mM Tris-HCl, pH 8.5（樣品可以長(zhǎng)期保存。推薦）或者去離子水重懸沉淀（沉淀中含有支原體），吹吸均勻（如果最初使用了1500 μL 的樣品，則支原體濃度大約提高了30倍）。（3）該重懸后的樣品可以直接檢測(cè)，也可以進(jìn)行熱處理后再檢測(cè)（熱處理后，樣品保存更穩(wěn)定）。熱處理過程：95 ℃加熱處理 5 min（可以轉(zhuǎn)移到 PCR 管內(nèi)，在 PCR 儀上進(jìn)行加熱處理），簡(jiǎn)單離心（1000 g，5 sec）后，取上清進(jìn)行檢測(cè)。
【注】：收集的待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液樣品如果不立即檢測(cè)，請(qǐng)放于-20℃或-80℃冰箱保存，不得放于室溫或4℃冰箱。樣品在-20℃至少可以保存1個(gè)月，在-80℃可以長(zhǎng)期保存。此外，為了節(jié)約檢測(cè)成本，可以將不同時(shí)間收集的樣品放于-20℃或-80℃冰箱保存，而后一起檢測(cè)。
2.反應(yīng)體系的配制
表1：恒溫反應(yīng)體系的配制

（1）將溶液Ⅰ、溶液Ⅲ從-20℃冰箱中取出，室溫放置待其融化，溶液Ⅱ從-20℃冰箱中取出后置于冰上備用。溶液Ⅱ、Ⅲ使用前各需1000rpm離心30 sec，用移液槍吹洗均勻。三種試劑按表1比例混合。
【舉例】：①如果待測(cè)樣品為8個(gè)（加上1個(gè)陰性和1個(gè)陽性對(duì)照），則樣品總數(shù)為10個(gè)。溶液Ⅰ的總體積為22.5×10×1.06=238.50 μL。溶液Ⅱ的總體積為1×10×1.06=10.60 μL。溶液Ⅲ的總體積為0.5×10×1.06=5.3 μL。將溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ混合均勻即可。②如果打算一個(gè)試劑盒一次使用完畢，可以按照以下方法進(jìn)行配制：直接往整管溶液Ⅰ（1150 μL）中加入50 μL 溶液Ⅱ和25 μL溶液Ⅲ，混合均勻即可。如果一次使用完畢，一個(gè)試劑盒大概可以檢測(cè)48-49個(gè)樣品。
【注】：①總體積中多配制6%（如果覺得該比例不合適，可以自己調(diào)整），是為了防止移液誤差，以保證每個(gè)反應(yīng)管中的反應(yīng)液足量。②溶液Ⅰ和溶液Ⅲ使用完后，請(qǐng)繼續(xù)放回-20 ℃冰箱中保存。③溶液Ⅱ必須一直在-20 ℃冰箱中保存（溶液Ⅱ在-20 ℃不會(huì)凍住），不能放于室溫。④溶液Ⅱ和溶液Ⅲ開蓋之前，請(qǐng)離心一下。
（2）將上述配制好的反應(yīng)體系，吹打均勻后，按每管24 μL分裝到0.2 mL的PCR管中。盡量保證每管的反應(yīng)液體積一樣。PCR管應(yīng)該使用透明度良好的薄壁PCR管。
（3）往測(cè)試管(Test)中加入1μL待測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液；往陽性對(duì)照管(Positive)中加入1 μL陽性支原體DNA；往陰性對(duì)照管(Negative)中加入1μL滅菌水；反應(yīng)液的總體積為25 μL。
【注】：①裝有陽性支原體DNA的螺口管開蓋之前，用力甩一下，或者用迷你離心機(jī)即可。
②進(jìn)行反應(yīng)體系配制的房間，與進(jìn)行樣品前處理、加陽性對(duì)照DNA、樣品DNA的房間最好分開。

3. 反應(yīng)
PCR儀設(shè)置程序：61℃，60 min；10℃，forever；熱蓋溫度，105℃。
【注】：若實(shí)驗(yàn)室反應(yīng)場(chǎng)所沒有PCR儀，可用水浴鍋代替，水浴鍋顯示溫度與實(shí)際溫度的溫差不超過0.5℃，另須往每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)加入25μL礦物油，以防止水份揮發(fā)，然后蓋上蓋子，將反應(yīng)管插入帶孔的漂板內(nèi)，放入已經(jīng)升溫到61℃的水浴內(nèi)，準(zhǔn)確反應(yīng)60 min。
4. 結(jié)果判斷
61℃反應(yīng)60 min后，立刻取出反應(yīng)管，放于室溫。以一張白紙或白色泡沫盒為背景，通過反應(yīng)管溶液顏色的變化，即可判斷檢測(cè)結(jié)果。如果溶液為藍(lán)綠色，則說明有支原體污染；如果為紫紅色，則說明沒有支原體污染(如圖1)。
【注】：如果反應(yīng)60 min，陽性對(duì)照效果不明顯，可以繼續(xù)反應(yīng)10 min。

產(chǎn)品圖片

注意事項(xiàng)
1.該產(chǎn)品僅限于科學(xué)實(shí)驗(yàn)研究使用，不得用于臨床診斷、治療等領(lǐng)域。
2.必須確保使用的移液槍本身沒有殘留的支原體，盡量用新購(gòu)移液器、新開封的槍頭操作。整個(gè)操作過程，佩戴kouzhao不要開口說話。由于本試劑盒非常靈敏，移液槍如吸附有，或者人為帶入支原體均有可能造成假陽性。
3.最好使用帶濾芯的吸頭吸取溶液和陽性支原體等。如果沒有帶濾芯的吸頭，至少應(yīng)該使用新開封的吸頭。
4.檢測(cè)過程中，用過的各類吸頭、離心管務(wù)必小心處理，應(yīng)裝入含有半瓶水的帶蓋的、可密封的垃圾瓶?jī)?nèi)。反應(yīng)后的PCR管，不要開蓋，用過后將其用自封袋密閉，扔到遠(yuǎn)離細(xì)胞房的獨(dú)立垃圾桶內(nèi)。
5.如果細(xì)胞被支原體污染，可以選購(gòu)本公司或其他供應(yīng)商提供的去除試劑盡早去除。
6.如待測(cè)樣品是低溫保存的血漿、血清、臍帶血、胰酶、抗生素、未使用的培養(yǎng)液等，這類樣品中支原體含量較低，為了保證支原體DNA的檢出率，可通過離心濃縮提高樣品DNA濃度，再進(jìn)行檢測(cè)。

7.如果反應(yīng)后，發(fā)現(xiàn)個(gè)別樣品的顏色介于陽性和陰性之間（正常這種情況應(yīng)該概率很低，如果經(jīng)常出現(xiàn)，樣品中可能含有可干擾正常指示效果的物質(zhì)，必須先去除。），可以將這些樣品繼續(xù) 61℃反應(yīng) 10  min。10  min后，如果其顏色仍然與陽性對(duì)照的顏色不同，該樣品應(yīng)該判為陰性。這種可疑樣品建議用相同試劑盒或者不同原理的其他試劑盒（如本公司的《PCR 法支原體檢測(cè)試劑盒》貨號(hào)：AC16L064、《發(fā)光法支原體檢測(cè)試劑盒》貨號(hào)：AC16L062 、《探針法支原體檢測(cè)試劑盒》貨號(hào)：AC16L068）進(jìn)行復(fù)檢。
8.反應(yīng)后，請(qǐng)勿打開反應(yīng)管的蓋子，否則有可能造成檢測(cè)環(huán)境的污染。
表2：Quick Cell 支原體快速檢測(cè)試劑盒(細(xì)胞培養(yǎng)專用)的優(yōu)勢(shì)

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