Quick Cell 發(fā)光法支原體檢測試劑盒

產(chǎn)品描述
　　Quick Cell發(fā)光法支原體檢測試劑盒，通過檢測支原體的特異性酶活性以達到檢測體外培養(yǎng)的哺乳動物細胞是否被支原體污染的目的。
　　在支原體裂解后，該支原體特異性的酶，在底物存在下，具有將ADP轉(zhuǎn)化成ATP的功能。由于熒光素酶（Luciferase）催化底物熒光素（Luciferin）產(chǎn)生光的反應需要ATP的參與，支原體特異性酶催化產(chǎn)生的ATP含量，可以通過該反應轉(zhuǎn)化成生物發(fā)光（Bioluminescence）信號，該信號可以使用專門的發(fā)光檢測儀（Luminometer）或具有發(fā)光檢測功能的多功能酶標儀進行檢測，發(fā)光的強度與ATP的含量成正比。通過比較細胞培養(yǎng)上清和未用于細胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液上清二者的支原體特異性酶的含量，即可知道培養(yǎng)的細胞是否被支原體污染。反應原理如下：

訂購信息

運輸與保存
干冰運輸。-20℃短期保存，-80℃長期保存；有效期60個月。
使用方法
1.檢測試劑的準備
　　產(chǎn)品從-80 ℃冰箱取出，在冰上操作，*使用，分別用2.5 mL支原體檢測溶液溶解試劑A和試劑B（注：因為試劑 A 和試劑 B 的離心管容量不足2.5 mL，可以分別先用1 mL 支原體檢測溶液將凍干的試劑 A 和試劑 B 溶解后，轉(zhuǎn)移到一個5 mL 或10 mL 的離心管中，再各補加1.5 mL 支原體檢測溶液）。按每管50 μL可分別分裝到50個1.5 mL離心管中，根據(jù)待檢測的樣品數(shù)量及陰性對照數(shù)量確定A、B試劑的用量（不用的試劑放置于-80 ℃冰箱低溫保存，隨用隨取）。試劑A和試劑B，放室溫5 min左右（注：不能加熱），等其熔解后放冰上待用。
【注】：試劑 A 和試劑 B 只能在每次檢測之前從-80 ℃冰箱取出的，熔解后在室溫放置的時間盡可能的短，不能超過20 min。熔解后，放冰上的時間也不能超2 h。已經(jīng)融化后的試劑 A 和試劑 B 不能再次凍存使用。
2.陰性對照的設置
　　本試劑盒每次檢測都必須設置陰性對照。陰性對照除了沒有培養(yǎng)細胞外其他成分*相同，包括其中的血清批次、含量、抗生素等含量也必須*相同。陰性對照配制完后放于4℃冰箱。如果有些樣品實在沒有合適的陰性對照或者不知道樣品原來的培養(yǎng)基組成，可以嘗試使用含10%血清的 DMEM 培養(yǎng)基作為陰性對照。
3.陽性對照的設置
　　可用已經(jīng)檢測含有支原體污染的樣品作為陽性對照。
4.待測樣品的準備
　　為了準確判斷細胞是否有支原體的污染，具體操作如下（請嚴格按照相應的體積進行操作）：
（1）貼壁細胞待測的細胞培養(yǎng)3 d且匯合度在70-90%左右時，取180μL-1500μL培養(yǎng)液上清，在普通臺式離心機上150 g (大約1000 rpm )低速離心 5 min，準確吸取離心后的上清到一個新的1.5 mL離心管內(nèi)，丟棄含細胞沉淀的原有離心管。懸浮培養(yǎng)的細胞需要在換液傳代后，至少讓細胞生長3 d再取培養(yǎng)液進行上述操作。
【注1】：離心力要嚴格控制在150 g左右，該離心力下，哺乳動物細胞將被沉淀下來而支原體不會。更高的離心力將可能導致支原體也被離心下來，從而導致假陰性。而更低的離心力將可能導致哺乳動物細胞不能被離心沉淀下來，從而導致支原體經(jīng)測時，哺乳動物細胞內(nèi)的ATP也被釋放到溶液中，從而導致假陽性。
【注2】：待測細胞上清樣品越多，越有利于支原體污染濃縮富集，1500μL培養(yǎng)液上清，經(jīng)后續(xù)處理后，支原體濃度提高10倍左右。
【注3】：制備好的待測樣品如果不是當天立即檢測，放于-80℃冰箱保存，不得放于室溫、4 ℃或-20 ℃冰箱，樣品在-80℃可以保存1 年；為了日后檢測方便，應該同時凍存一些作為陰性對照的培養(yǎng)液。
（2）將含有上清的1.5 mL離心管，在臺式離心機上16000 g（大約13000 rpm）高速離心5 min，棄去上清。
【注】：切勿讓吸頭碰到離心管底部，底部為可能含有支原體的沉淀。往離心管內(nèi)，加入120 μ*期配好的陰性對照培養(yǎng)液。
（3）將上述經(jīng)過離心清洗一次的樣品，再次在普通臺式離心機上16000 g（大約 13000 rpm）高速離心 5 min，同樣小心吸走離心后的上清并丟棄。
【注】：同樣勿讓吸頭碰到離心管內(nèi)壁的底部外側(cè)。留下大約5 μL培養(yǎng)液的目的也是為了防止吸頭碰到離心管底部外側(cè)而將可能含有支原體的沉淀吸走；注意離心管放置方向與上一次離心時相同。
（4）向上述經(jīng)過兩次離心清洗的樣品中加入115 μL陰性對照的培養(yǎng)液，用移液槍上下吹吸10-20 次，將可能含有支原體的沉淀吹打均勻，用于后續(xù)支原體檢測（夠兩次檢測使用）。此時，總體積仍然約為120 μL）。
【注】：將培養(yǎng)液替換成陰性對照的培養(yǎng)液是為了排除一些細胞代謝產(chǎn)物對后續(xù)檢測的可能干擾。
5.支原體樣品檢測
（1）將溶解后的試劑 A、試劑 B放冰上融化（注意：不能加熱），試劑A和試劑B融化后立即用于檢測。試劑A、試劑B融化1 h后，檢測靈敏度開始顯著降低，試劑 A和試劑 B融化后不能反復凍融使用。
（2）吸取50 μL陰性對照、陽性對照和待測樣品，分別移入不透明（白色或者黑色均可）的96孔板內(nèi)，加入50 μL冰上放置的試劑 A，室溫反應 15 min。
【注】：不能使用透明的 96 孔板，否則孔與孔之間的發(fā)光值會互相干擾。
（3）吸取50 μL冰上放置的試劑B，加入到已反應15 min的上述反應液中，立即在多功能酶標儀或者發(fā)光檢測儀（Luminometer）上，以儀器默認的螢火蟲熒光素酶（Luciferase）的發(fā)光檢測參數(shù)的參數(shù)進行發(fā)光值的檢測，5 min內(nèi)，連續(xù)測5次陰性對照和待測樣品的發(fā)光值，計算各自的平均值。
【注1】：發(fā)光檢測（Luminescence）與熒光檢測（Fluorescence）、吸收光檢測（Absorbtance）是不同的功能。吸收光檢測即常用的 OD 值檢測。熒光檢測（比如常見的 FITC 檢測）需要激發(fā)光，而發(fā)光檢測（如熒光素酶的活性檢測）不需要激發(fā)光。多功能酶標儀常見的檢測功能有：吸收光檢測、熒光檢測和發(fā)光檢測，三種功能為獨立的功能。您如果不清楚您實驗室的酶標儀是否具有發(fā)光檢測功能，請咨詢您的實驗室主任或者酶標儀廠家。
【注2】：發(fā)光檢測時，應該選擇不加載任何濾光片（不同酶標儀表達方式不一樣，可能是：Unfiltered LUM、All wavelengths 或 Open hole）進行檢測（此時讀值較高）或者使用螢火蟲熒光素酶（Luciferase）峰值的發(fā)光波長560 nm進行檢測（此時讀值較低）。
【注3】：可以通過調(diào)節(jié)酶標儀的檢測靈敏度（Sensitivity）或延長發(fā)光檢測的時間（Integration time，Measurement time），盡量讓陰性對照的發(fā)光值大于 1000。
【注4】：如果樣品是無血清細胞培養(yǎng)上清，相應的陰性對照培養(yǎng)基因不含血清，其發(fā)光值可能會比較低， 甚至只有 100 左右的發(fā)光值，此時可以在陰性對照培養(yǎng)基中加入10%的胎牛血清或小牛血清，當然無血清細胞上清樣品也必須用含10%的胎牛血清或小牛血清的陰性對照培養(yǎng)基進行替換（高速離心后替換，見上述步驟4）后，再進行檢測。加入血清后一般可以明顯提高陰性對照的發(fā)光值。
6.結(jié)果判斷
　　計算待測樣品的發(fā)光平均值與陰性對照的發(fā)光平均值的比值：
（1）如果比值>1.2，說明待測樣品有支原體污染（陽性）。嚴重的污染該比值可以達到10以上。
（2）如果比值在1.1-1.2之間，說明待測樣品可疑有支原體污染（可疑陽性）。該樣品需要繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時后，重新檢測。如果繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時后，重新檢測的比值仍然在1.1-1.2之間，應該判為陰性。
（3）如果比值<1.1，說明待測樣品無支原體污染（陰性）。

表1：本試劑盒產(chǎn)品優(yōu)勢

產(chǎn)品圖片

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