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細胞培養支原體污染來源/檢測/預防/去除

更新時間:2017-02-22點擊次數:3114

細胞培養支原體污染來源/檢測/預防/去除

一、細胞培養支原體污染來源及主要支原體種類

       支原體(Mycoplasma)是一種大小介于細菌和病毒之間(0.1 - 0.6μm),沒有細胞壁、并獨立生活原核生物,形態呈高度多形性,呈圓形、絲狀或梨形。由于支原體直徑較小,進行除菌過濾是,約1%的支原體可以直接穿過常規的0.22μm的微孔除菌濾膜,造成細胞的支原體污染。支原體污染的來源包括:(1)工作環境的污染,實驗器材帶來的污染;(2)操作者本身的污染(一些支原體在人體是正常菌群);(3)已受污染的培養基、血清,或用來制備細胞的原始組織或器官的污染;(4)污染支原體的細胞造成的交叉污染。

       目前,已發現的支原體品種有100多種,但根據國內外相關研究發現,大約有二十多種支原體能污染細胞,有的細胞株可以同時污染兩種以上的支原體。以下13種支原體污染在全部支原體污染中所占比例超過99%。(1)M. orale、(2)M.Arginini、(3)M.Hyorhinis、(4)A.Laidlawii、(5)M.Fermentans、(6)M. salivarium、(7)M.pirum、(8)M. hominis、(9)M. agalactiae、(10)M.bovis、(11)M. buccale、(12)M. arthritidis、(13)M. pulmonis。其中尤其是前四種:M.orale(口腔支原體)、M.arginini(精氨酸支原體)、M.hyorhinis(豬鼻支原體)和A.laidlawii(萊氏無膽甾原體)所占污染比例超過95%,前8種占比超過98%。

二、支原體污染對細胞培養的危害

1、支原體污染的普遍性

       支原體污染是細胞培養領域遇到的性問題,據文獻報道,綜合美國食品藥品監督管理局(FDA)、美國模式菌種收集中心(ATCC)等機構收到的相關數據,世界各國細胞系支原體污染的平均比例為30-60%。該數據未統計中國大陸的數據,但可以確定,大陸地區的支原體污染比例與此相當,或更嚴重。

表1.部分國家及機構細胞系污染數據統計

Cell Line

USA-ATCC

USA-FDA

Germany-DSM

Argentina

Japan-IFO

Rate

14%

15%

15%

65%

80%

2、支原體污染的危害

根據已發表的支原體污染研究文獻,支原體污染細胞后,幾乎能影響每一個細胞參數。

(1)支原體污染可能導致細胞染色體的異常和損傷,改變細胞的代謝、生長、形狀、附著。

(2)支原體影響被污染細胞的基因表達。相關研究表明,支原體污染的細胞系與對照組比較,有多達200個基因表達差異達2倍以上。

(3)導致MTT等細胞毒性實驗結果嚴重錯誤。支原體對MTT有額外還原作用。

(4)支原體污染能耗盡營養物,促進代謝積累,重度支原體污染導致pH改變。

(5)誘導或抑制細胞因子表達,并改變培養細胞的代謝、增殖特征及形態。支原體污染可以直接影響L-arginine的代謝

(6)支原體污染可以誘導樹突狀細胞成熟,這對于開展人體免疫細胞的腫瘤治療的影響將是災難性的。

3、支原體污染的隱蔽性

      支原體大小約0.1 - 0.6微米,體積比病毒稍大,輕度到中度的支原體污染不會明顯改變細胞培養液的渾濁度和pH值,也不會導致細胞形態或生長速度的明顯改變,所以科研人員很難及時發現體外培養的細胞已經被支原體污染,進而改變了基因表達譜,顯示虛假的實驗數據和實驗結果。通常情況下,如果不排除支原體污染因素,很多實驗結果往往缺乏說服力。2013年,*期刊《Nature》明確要求,在涉及細胞培養的科研工作中,必須進行支原體檢測,并排除其影響。

三、支原體污染檢測

1、支原體檢測方法概述

      支原體污染嚴重干擾細胞實驗結果,檢測有無支原體污染的方法較多,可以根據自身實驗室條件、檢測方法便捷性等作出選擇。

       電子顯微鏡,相差顯微境觀察。用掃描電鏡或透射電鏡,直觀觀察支原體形態。或者在細胞培養瓶內預置蓋玻片,接種細胞在蓋玻片上,培養24小時后取出用油鏡觀察。如有支原體,因支原體與細胞在不同平面,可發現支原體呈現暗色顆粒裝。缺點:設備要求嚴格,檢測成本高,不適合普通實驗室日常常規檢測。

      DNA熒光染色法,利用支原體沒有細胞膜(壁)的特性,用熒光染料Hoechst 33258染色, Hoechst 33258能與支原體DNA結合著色,在熒光顯微鏡下觀察,呈現綠色小點。缺點:靈敏度太低,當檢測成陽性時,細胞經常已經嚴重污染。

  培養法,用支原體培養基大量增殖支原體,是相對可靠的支原體檢測技術。缺點:耗時長,需要數周時間才能得到結果,不適合作為細胞培養液中支原體污染的快速檢測。此外,該方法不能檢測豬鼻支原體,因為豬鼻支原體不能在固體培養基上形成可見的菌落,豬鼻支原體(M.Hyorhinis)約占所有支原體污染的20-50%。

       PCR法,提取細胞培養液,提取支原體,制備樣品,根據支原體高度保守的16SrRNA序列設計引物(避免真核細胞或細菌DNA干擾),設置陰性,陽性對照,擴增產物經電泳后成像觀察,可識別已發現的幾乎全部100余種支原體。

       Quick Cell快速檢測法,拓撲酶環化支原體DNA,在根據高保守區設計的引物引導下,采用特殊等溫DNA擴增酶,61℃條件下,連續滾環式擴增支原體DNA 60分鐘,根據有無支原體污染,隨著擴增進程可目視實驗結果。

       化學發光法,裂解支原體后,有底物情況下,支原體特異性的酶,能將ADP轉化成ATP。ATP參與熒光素酶(Luciferase)催化底物熒光素(Luciferin)產生光的過程,所以可以通過催化底物熒光素導致的生物發光(Bioluminescence)信號來判別支原體DNA存在與否。

      綜上所述,在多種支原體檢測方法中,受實驗條件、實驗時長、便捷性等因素限制,-僅在很少情況下得到應用。實際科研工作中,應用的是 PCR支原體檢測法;Quick Cell快速支原體檢測法;化學發光支原體檢測法。

2、幾種zui常用支原體檢測方法比較

檢測方法

Quick Cell快速檢測法

化學發光法

PCR法

檢測原理

環化DNA等溫連續擴增

支原體特異性酶檢測

根據支原體DNA序列設計引物進行PCR擴增

實驗條件

恒溫水浴或PCR儀

-80℃超低溫冰箱,多功能酶標儀或發光檢測儀

常規PCR儀,電泳儀,成像系統

靈敏度

比PCR法高1-2個數量級

與PCR法相當

較靈敏

檢測時長

1小時

25分鐘

2-3小時

定性/定量

定性

定性,半定量

定性,半定量

污染
假陽性率

引物
假陽性率

樣品制備

直接取上清,不需制備

需要樣品制備

離心

檢出
正確率

>99%

>99.9%

>80%

綜合評價

1)簡便、快速,任何實驗室均可操作;2)擴增不受細胞代謝產物影響,高準確率

1)快速,準確;2)有特定設備要求,物流儲存條件高。

1)較高的檢出準確率;2)PCR反應易受培養基成分抑制,產生假陰性;3)需制備樣品。

代表性
產品

Quick Cell 快速支原體檢測(李記生物, CAT:C4056L1060)

*本產品由細胞專家李記生物*研發

Quick Cell 支原體發光法檢測試劑盒(李記生物,CAT:C4056L1065

MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit (Lonza, CAT: LT07-710)

Quick Cell 支原體PCR檢測試劑盒(李記生物,貨號: C4056L1062

Lookout Mycoplasma Detection Kit.(Sigma貨號:MP0035)

3、支原體檢測策略及方法選擇

單個方法獨立檢測支原體(正確檢出率80%-99.9%)

      就單個檢測方法及原理而言,“化學發光法”擁有zui高的正確檢出率(99.9%),用時zui短,應為方法。可選產品為Lonza公司的MycoAlert Plus Mycoplasma Detection Kit (CAT:C4056L1065,價格:約9800元/100次),或李記生物公司的“Quick Cell 支原體發光法檢測試劑盒(CAT:C4056L1065,價格:1250元/50次)”。

      若受實驗室條件所限沒有配備化學發光檢測儀,或多功能酶標儀,建議選擇“Quick Cell快速檢測法”,該方法1小時出結果,避免了PCR法因細胞代謝產物抑制PCR反應導致的假陰性出現,正確檢出率大于99%,對設備幾乎無要求,可目測結果。產品可選李記生物公司的“Quick Cell支原體快速檢測試劑盒(CAT:C4056L1060,價格:1250元/50次)”。

多原理支原體檢測策略

      市場在售的所有支原體檢測試劑盒,目前沒有一種可以檢出全部可能的支原體污染,如果從事細胞治療、進行干細胞培養、生產血清、胰酶、培養液工作的科研人員,強烈建議選擇兩種以上檢測方法,確保支原體正確檢出率達到100%,避免關鍵實驗不必要的損失。

      細胞培養支原體污染是個普遍性問題,污染來源很多,根據國外生物實驗室的規范做法,實驗室的支原體檢測要定期進行,一般一個月做一次支原體檢測,可以*時間確定支原體污染情況,顯著降低或避免支原體污染對細胞培養相關實驗的影響。

四、支原體污染去除

1、支原體污染預防

      根據可能的支原體污染來源,在體外細胞培養過程中,要嚴格控制環境污染;嚴格實驗操作;細胞培養基和實驗器材、耗材要保證無菌;在不影響實驗結果的前提下,可在細胞培養基中加入適量的特定抗生素;發現支原體污染后,要清除支原體,防微杜漸。

2、支原體污染的去除及預防

      因為支原體沒有細胞壁,一般用于細胞壁合成的抗生素對支原體沒有作用,如青霉素、萬古霉素多粘菌素(polymycin)、利福平、磺胺藥物普遍沒什么效果。對支原體zui有抑制活性及常用于支原體去除的抗生素是四環素類、大環內酯類及一些氟喹諾酮。在低濃度時,這些抗生素不會產生耐藥性,且對哺乳動物細胞的毒性較小。四環素和大環內酯能結合30S和50S核糖體亞基,從而抑制支原體蛋白質合成,喹諾酮抑制DNA旋轉酶。因此可以在細菌DNA復制及蛋白質合成兩個層面上抑制細菌生長,明顯增強除菌效果。

3、支原體去除試劑選擇

      選擇支原體去除試劑需要注意幾個關鍵幾點:細胞毒性小,毒性大的試劑在去除支原體的同時,會殺死細胞;支原體去除效果,選擇廣譜試劑,去除多種支原體,以及細菌,真菌等;操作簡便,沒有二次污染;要考慮操作使用是否方便,因為如果使用起來比較麻煩,首先是費時費力,另外可能會帶來二次污染。目前市場上有多種支原體去除&預防試劑可選。包括李記生物的Quick Cell支原體預防/去除試劑,美國GenDEPOT公司的Cellmaxin,羅氏公司的BM-Cyclin,BiolndBIOMYC-1,BIOMYC-2,BIOMYC-3,以及Invivogen 公司的Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment 等。

      Quick Cell支原體預防及去除試劑和Cellmaxin都是從蛋白和DNA兩個層面去除支原體,抗菌譜廣。不同在于Quick Cell的使用者可以靈活選擇單獨或聯合使用兩種成分,分別或同時在蛋白或DNA層面去除支原體污染,細胞毒性更小。作用周期1-2周,支原體去除率大于92%。去除預防兼顧

      BM-Cyclin包含泰妙菌素(BM-Cyclin 1)和二甲胺四環素(BM-Cyclin 2)兩種成分,抑制支原體及細菌生長,去除培養細胞中已感染的支原體。適用于多種培養細胞,無明顯副作用,又不影響細胞本身的代謝,而且處理過的細胞不會重新感染支原體。BM-Cyclin需聯合使用,作用周期2周,可消除80%以上的支原體。不確定能否預防。

      BIOMYC-1基于抗生素泰妙菌素,由真菌pleurotus mutilus 產生。 BIOMYC-2基于二甲胺四環素,四環素衍生物。此兩種抗生素溶液通常按先后聯合使用2-3次循環約一周以上,可取得良好的效果。BIOMYC-3 基于抗生素環丙沙星,屬于氟喹酮類。許多支原體被證明對BIOMYC-3敏感,需要根據支原體種類使用。處理周期2周,能去除90%的支原體。是否可以預防支原體目前還不能確定。

       Plasmocin™ prophylactic和Plasmocin™ treatment也是兩種抗生素的混合物,包含兩個針對支原體的有效成分,作用于蛋白質合成和DNA復制階段,對許多細菌和真核細胞則沒有影響。作用周期2周,去除效率未知。有兩個濃度包裝,去除用高濃度,預防用低濃度。

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